MÓDULO 3 – AULA 4
Suplementos dos meios de cultura

Quando se adquire o meio basal, é necessário realizar a sua suplementação antes de sua utilização. Existem os suplementos gerais, como o bicarbonato de sódio, HEPES, L-glutamina, antibióticos e antimicóticos. Com relação a glutamina, o meio base já traz glutamina em sua composição, mas por sofrer degradação térmica, esse composto precisa de reposição periódica.
Existem também suplementos específicos que são utilizados em processos específicos, como fatores de crescimento, vitaminas e suplementos serum free.

 

Controle de pH e sistema tampão bicarbonato de sódio em estufas de CO₂. A manutenção do pH fisiológico na faixa de 7,2 – 7,4 é crucial para a maior parte das células em cultivo. Para tal, em cultivo celular se emprega o uso do indicador de pH vermelho de fenol, que indica o pH aproximado de acordo com a faixa de cor. Aliado à observação visual do pH do cultivo celular, se utilizam as estufas de CO₂ a fim de manter o pH na faixa fisiológica. O bicarbonato de sódio na fase líquida se dissocia íon sódio e íon bicarbonato, o qual, por sua vez, reage com H+ para a formação do ácido carbônico que se dissocia em CO₂ e água. Essas duas reações se mantêm em equilíbrio constante. O CO₂, na fase líquida também mantém o equilíbrio com o CO₂ na fase gasosa, assim mantendo o pH 7,2 – 7,4. Adaptado de Moraes, Augusto e Castilho (2007), Yao & Assayama (2017), Abud (2021) e Weiskirchen, S et al (2023). Fonte: Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A. (2025) https://BioRender.com/o20y551 adaptado de modelo “Life in the Lab: How to Control pH in Media” e modelo “Color and pH of Culture Media” de Sally Kim, obtidos de https://app.biorender.com/biorender-templates acesso em 23/01/2025. “Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A imagem esquematiza o funcionamento do sistema tampão bicarbonato de sódio em meios de cultura de células mantidos em estufas de CO₂. No topo da imagem, há frascos contendo meio de cultura com diferentes colorações, variando de amarelo (pH ácido) a rosa-escuro (pH básico), com uma escala de pH abaixo indicando valores de 6,5 a 7,8. As legendas associadas orientam sobre a ação recomendada para cada faixa de pH, como troca imediata do meio quando muito ácido ou verificação do fornecimento de CO₂ quando muito alcalino. Na parte inferior, há um frasco de cultivo contendo meio de cultura vermelho equilibrado, com reações químicas ilustradas: a dissociação do bicarbonato (HCO₃⁻) e sua interação com íons H⁺ formando ácido carbônico (H₂CO₃), que se decompõe em CO₂ e água, regulando o pH. Ao lado, há um esquema de uma incubadora a 37°C com 5% de CO₂, indicando sua função na regulação do pH do meio de cultura. A ilustração destaca como o equilíbrio entre CO₂ na fase gasosa e líquida influencia o pH do meio de cultivo, sendo essencial para a manutenção das condições ideais para crescimento celular.

 

Suplementos gerais

Sistema tampão - Bicarbonato de sódio
O bicarbonato é um tampão comumente usado para manutenção do pH. Para isso, o frasco de cultura é mantido em incubadora de CO₂ com controle da pressão desse gás na sua atmosfera. Aliado ao controle de pH está o indicador vermelho de fenol, que muda de cor de acordo com o pH do meio de cultivo, indicando se o cultivo está no pH ótimo ou não.
O mecanismo de controle de pH nos meios de cultura ocorre com base no sistema tampão do bicarbonato. Quando dissolvido em água, bicarbonato de sódio dissocia em íon de sódio e íon bicarbonato, o qual, por sua vez, reage com H+ para a formação do ácido carbônico que se dissocia em CO₂ e água. Essas duas reações se mantêm em equilíbrio constante. O CO₂, por sua vez, em solução, também mantém o equilíbrio com o CO₂ na fase gasosa.

Controle de pH e sistema tampão bicarbonato de sódio em estufas de CO₂. A manutenção do pH fisiológico na faixa de 7,2 – 7,4 é crucial para a maior parte das células em cultivo. Para tal, em cultivo celular se emprega o uso do indicador de pH vermelho de fenol, que indica o pH aproximado de acordo com a faixa de cor. Aliado à observação visual do pH do cultivo celular, se utilizam as estufas de CO₂ a fim de manter o pH na faixa fisiológica. O bicarbonato de sódio na fase líquida dissocia íon de sódio e íon bicarbonato, o qual, por sua vez, reage com H+ para a formação do ácido carbônico que se dissocia CO₂ e água. Essas duas reações se mantêm em equilíbrio constante. O CO₂, na fase líquida também mantém o equilíbrio com o CO₂ na fase gasosa, assim mantendo o pH 7,2 – 7,4.

HEPES
O HEPES possui alta capacidade de tamponamento, especialmente quando as células em cultura são mantidas fora do ambiente com a atmosfera de CO₂ por muito tempo. Assim, o pH do meio com HEPES é mais estável do que apenas com o bicarbonato. Também pode ser benéfico em culturas de células com altas densidades, onde o pH pode cair rapidamente devido ao acúmulo de metabólitos, por exemplo, como o lactato. Em meio sem soro, que carece da capacidade de tamponamento do soro, a ação do HEPES poderia ser ainda mais relevante. No entanto, o HEPES pode apresentar efeitos negativos, como a produção de metabólitos citotóxicos, principalmente peróxido de hidrogênio durante a exposição do meio à luz visível.

L-glutamina
A glutamina juntamente com a serina e a metionina, destacam-se como aminoácidos limitantes do crescimento celular.
A glutamina atua como fonte de carbono, nitrogênio e energia, sendo normalmente adicionada ao meio de cultivo em concentrações elevadas, variando de 1 a 5 milimolar. Deve se dar atenção especial a esse nutriente, sendo que a glutamina sofre degradação térmica, por exemplo, a 35ºC, 50% da glutamina se degrada em cerca de nove dias. Assim, deve ser reposta periodicamente.
O principal subproduto gerado do metabolismo da glutamina é o amônio, que assim como o lactato, apresenta efeito tóxico e inibição de crescimento.

Antibióticos e antimicóticos
São utilizados para minimizar a contaminação por bactérias e fungos nas culturas celulares. Antes da utilização desse insumo, é necessário determinar a concentração a ser utilizada, que não resultará em toxicidade ou comprometimento do metabolismo celular. No laboratório, nós optamos por não utilizar antibiótico durante a manutenção das células, utilizando apenas durante o ensaio, seguindo as recomendações de cada protocolo.
Também é necessário se conhecer as características químicas, mecanismos de ação e cuidados necessários antes da utilização de cada insumo.

Soro
Como já comentado o soro é um suplemento muito importante utilizado na composição dos meios de cultura, o qual abordaremos com mais detalhes em um tópico específico.

Suplementos específicos
São utilizados na manutenção e/ou indução de processos celulares, como por exemplo, indução da diferenciação de células-tronco em diversas linhagens. Aqui são exemplos de suplementos específicos, como por exemplo, fatores de crescimento, exemplo FGF Beta e TGF Beta. Vitaminas, como por exemplo, ácido ascórbico. E suplementos serum free, aqueles que são utilizados para suprir a ausência do soro, como por exemplo temos o B27, que é uma solução que contém vitaminas, proteínas, ácidos graxos, hormônios, entre outros, e o ITS-A, que é uma solução que contém insulina, transferrina, selenito e piruvato de sódio.

 

Suplementos mais comuns em meios de cultivo. Ao meio basal, 100% definido são adicionados outros suplementos, onde tipo e concentração dependem dos requerimentos específicos de cada tipo celular. Os mais comuns são os sistemas de tampão como bicarbonato de sódio e HEPES para manutenção do pH fisiológico, e outros suplementos como soro, L-glutamina, antibióticos e antimicóticos ou mesmo suplementos específicos. Adaptado de Moraes, Augusto e Castilho (2007), Yao & Assayama (2017), Abud (2021) e Weiskirchen, S et al (2023). Fonte: Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A. (2025) https://BioRender.com/c76x254 adaptado de modelo ““Components of Cell Culture Media” de Sally Kim, obtidos de https://app.biorender.com/biorender-templates acesso em 23/01/2025. “Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: Descrição estendida da legenda: A imagem ilustra os suplementos mais utilizados em meios de cultura celular. No centro da figura há frascos de meio de cultura, com setas apontando para diferentes categorias de suplementos. No canto superior esquerdo, há um esquema representando o sistema tampão HEPES, composto por moléculas dispersas em solução. No canto superior direito, um esquema mostra o sistema tampão bicarbonato de sódio, com íons H⁺ e HCO₃⁻ regulando o pH. Na parte inferior, há três categorias de suplementos adicionais: Suplementos específicos: Incluem fatores de crescimento e outras moléculas que variam conforme a necessidade celular; Soro: Representado por um frasco com líquido amarelado, fonte de proteínas e fatores necessários ao crescimento celular; L-glutamina: Um aminoácido essencial para a manutenção do metabolismo celular, representado por sua fórmula química; Antibióticos e antimicóticos: Representados por frascos contendo líquidos azul e vermelho, usados para evitar contaminações por bactérias e fungos. A ilustração destaca a importância de cada componente na formulação de meios de cultura adaptados às necessidades celulares.

 Saiba mais em conteúdos do curso: Nos módulos de estrutura laboratorial e equipamentos de técnicas básicas é possível conhecer mais caracteristicas dos equipamentos utilizados além de assistir videoaulas sobre suplementação de meio de cultura.

Para saber sobre esse tema assista a nossa videoaula e acesse o texto da transcrição: