MÓDULO 5 – AULA 6
Criopreservação - Congelamento Celular

Um dos procedimentos mais utilizados em cultivo celular é a criopreservação ou congelamento celular. São utilizadas temperaturas muito baixas para preservar as características dos cultivos celulares por longos períodos (MOLINARO e CAPUTO e AMENDOEIRA, 2013) e quando necessário é possível descongelar as células e com viabilidade celular adequada para retomada dos experimentos.  

Saiba mais em conteúdos do curso: No módulo de criopreservação é possível conhecer detalhes do procedimento e no módulo de estrutura laboratorial e equipamentos são apresentados os equipamentos utilizados no processo de congelamento celular.

Saiba mais ainda:
O tema criopreservação é abordado com mais detalhes na dissertação de mestrado da autora:

KULIGOVSKI, Crisciele. Estabelecimento de banco de linhagens celulares aplicadas a pesquisa científica e ensaios toxicológicos in vitro. 2020. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) – Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curitiba, 2020. Disponível em: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/24680. Acesso em 07/05/2021

 

PROTOCOLO MODELO DE CONGELAMENTO CELULAR

Esse protocolo pode variar de acordo com procedimentos adotados em cada laboratório.

O conteúdo a seguir foi adaptado do procedimento descrito na dissertação de mestrado da autora:

KULIGOVSKI, Crisciele. Estabelecimento de banco de linhagens celulares aplicadas a pesquisa científica e ensaios toxicológicos in vitro. 2020. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) – Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curitiba, 2020. Disponível em: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/24680. Acesso em 07/05/2021.

a) Observar a confluência da garrafa da linhagem a ser congelada, recomenda-se uma confluência entre 80 e 90% que garanta um congelamento em fase exponencial da curva de crescimento celular;
b) Lavar as células uma vez com solução salina de PBS 1X ou BSS.CMF sem cálcio e sem magnésio a fim de facilitar a desagregação celular;
c) Após as células serem lavadas adicionar a solução de Tripsina 0,05% p/v / EDTA 0,02% p/v e manter em incubadora por período de 3 – 5 minutos para desaderência celular;
d) Observar no microscópio invertido se as células estão desaderindo;
e) Após as células serem desaderidas colocar o meio de cultura suplementado com soro fetal bovino para inativar a tripsina;
f) Contar as células em câmara de Neubauer; Durante a contagem e realização dos cálculos manter o tubo cônico contendo a suspensão celular no gelo, a fim de evitar adesão celular ao tubo ou formação de agregados celulares;
g) Centrifugar as células a 120 g por 7 minutos centrífuga refrigerada a 8ºC;
h) Preparar o meio de congelamento contendo 5% Dimetilsufóxido (DMSO) e 95% Soro Fetal Bovino (SFB) em tubo de centrífuga com fundo cônico estéril;
i) Adicionar 1 mL da solução de congelamento para cada criotubo a ser preparado, obtendo densidade mínima celular recomendada de 1 x 10⁶ células/mL em cada criotubo no mínimo e transferir a suspensão celular para criotubos;
j) Identificar o criotubo da seguinte forma;
Linhagem celular
Passagem
Concentração de células por/mL Data de congelamento
Responsável Número da ampola
k) À medida que o (s) criotubo (s) vão sendo fechados eles devem permanecer em isopor com gelo;
l) Em seguida colocar o (s) criotubo (s) no Nalgene® Mr. Frosty Cryo 1 ºC Freezing Container;
m) Colocar o (s) criotubo (s) contendo as amostras nas cavidades do suporte;
n) Colocar o container no fundo do freezer -80ºC. Deixar o container no -80ºC por no mínimo 4 horas;
o) Remover o (s) criotubo (s) congelados do Nalgene® Mr. Frosty Cryo 1 ºC Freezing Container e colocá-los no nitrogênio líquido (-196ºC);

Criopreservação de linhagens aderentes. Protocolo modelo de cultivo celular. Adaptado de American Type Culture Collection (2014) e Freshney 2010. Fonte: Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A.,Souza, A.C.G., Barisón, M.J. (2025) https://BioRender.com/q03k455. Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A figura apresenta um protocolo esquemático para criopreservação de células aderentes, detalhando todas as etapas do processo: 1) Observação ao microscópio: Antes do congelamento, as células devem ser analisadas para verificar saúde e viabilidade celular, observando contaminações, alterações morfológicas e confluência da cultura. 2) Organização do material: Todos os equipamentos e reagentes necessários devem ser preparados, garantindo que os procedimentos sejam realizados em cabine de segurança biológica. 3) Repique celular: Realiza-se o procedimento de subcultura celular, garantindo que a viabilidade celular seja superior a 90% antes do congelamento. 4) Preparação da solução crioprotetora: A solução crioprotetora é composta por 5% de DMSO (dimetilsulfóxido) e 95% de soro fetal bovino (SFB), garantindo proteção contra danos pelo congelamento. 5) Preparo dos criotubos: Cada criotubo recebe 1mL da solução de congelamento, contendo 1×10⁶ células/mL, garantindo a densidade mínima recomendada. 6) Identificação dos criotubos: Cada criotubo deve ser etiquetado com informações como linhagem celular, número de passagem, concentração celular, data e responsável pelo congelamento. 7) Container de congelamento: Os criotubos são mantidos inicialmente em um container de congelamento celular, que promove um resfriamento gradual para evitar choque térmico. 8) Armazenamento em ultra-freezer (-80°C): Os criotubos são colocados no ultra-freezer a -80°C por um mínimo de 4 horas, para garantir um congelamento inicial adequado. 9) Transferência para nitrogênio líquido (-196°C): Após o pré-congelamento no freezer, os criotubos são transferidos para um container de nitrogênio líquido (-196°C) para armazenamento a longo prazo. 10) Registros: Todo o procedimento deve ser documentado, garantindo rastreabilidade e controle do processo de criopreservação. Em resumo, o processo pode variar dependendo da linhagem celular e do protocolo específico do laboratório.

 

Para saber sobre esse tema assista a nossa videoaula e acesse o texto da transcrição:

 

 

 

Saiba mais em conteúdos do curso: No módulo de estrutura laboratorial e equipamentos e no módulo de congelamento celular e banco de células é possível conhecer mais caracteristicas dos equipamentos e procedimentos utilizados em criopreservação.

DESCONGELAMENTO CELULAR
Para iniciar o cultivo de células é necessário realizar o descongelamento celular. Que consiste em um processo de recuperação do material criopreservado. O descongelamento celular ideal deve ser rápido e realizado em banho–maria a 37ºC removendo o meio de congelamento por centrifugação e/ou diluição com meio de crescimento.

PROTOCOLO MODELO DE DESCONGELAMENTO CELULAR COM CENTRIFUGAÇÃO

Esse protocolo pode variar de acordo com procedimentos adotados em cada laboratório.

O conteúdo a seguir foi adaptado do procedimento descrito na dissertação de mestrado da autora:

KULIGOVSKI, Crisciele. Estabelecimento de banco de linhagens celulares aplicadas a pesquisa científica e ensaios toxicológicos in vitro. 2020. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) – Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curitiba, 2020. Disponível em: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/24680. Acesso em 07/05/2021.

a) Retirar o(s) criotubo(s) cuidadosamente do reservatório de nitrogênio líquido; e colocar a ampola em gelo seco até o descongelamento;
b) Colocar o(s) criotubo(s) em banho-maria 36,5ºC para descongelar o conteúdo do(s) criotubo(s);
c) Em cabine de segurança biológica, adicionar o conteúdo do(s) criotubo(s) em tubo cônico de centrífuga com capacidade para 15 mL contendo 9ml de meio suplementado adequado ao crescimento celular;
d) Centrifugar por 7 – 9 minutos a 120 g em centrífuga refrigerada a 4ºC;
e) Descartar o sobrenadante;
f) Suspender o precipitado em meio de cultura adequado à linhagem celular;
g) Recolher alíquota para realizar contagem, calcular a viabilidade celular;
h) Plaquear todo conteúdo do criotubo em frasco de cultura adequado;
i) Incubar a 36,5ºC ±0,5ºC  em atmosfera de 5% CO2 quando adequado;

Descongelamento celular com centrifugação. Protocolo modelo de cultivo celular. Adaptado de American Type Culture Collection (2014 e Freshney 2010. Fonte: Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A.,Souza, A.C.G., Barisón, M.J. (2025) https://BioRender.com/u81t083. Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A figura apresenta um protocolo esquemático de descongelamento celular utilizando centrifugação, detalhando cada etapa do processo: 1) Organização do material: Equipamentos e reagentes necessários devem ser organizados previamente, garantindo que todos os procedimentos sejam realizados em cabine de segurança biológica. 2) Retirada do criotubo do container de nitrogênio líquido: O criotubo deve ser retirado cuidadosamente do recipiente de nitrogênio líquido (-196°C) e colocado em recipiente com gelo seco, evitando choque térmico abrupto. 3) Descongelamento do criotubo: O criotubo deve ser colocado imediatamente em banho-maria a 36,5°C, garantindo um descongelamento rápido e homogêneo. 4) Preparação da suspensão celular: Em cabine de segurança biológica, o conteúdo do criotubo é transferido para um tubo de centrifugação contendo meio de cultivo suplementado. 5) Remoção da solução crioprotetora: O meio de cultura com soro fetal bovino (SFB) é adicionado ao tubo, seguido de centrifugação (120 g a 2000 rpm por 7 min a 4°C) para remover o crioprotetor. O pellet celular é então ressuspendido em meio de cultivo fresco e suplementado. 6) Contagem celular e viabilidade: Uma amostra é misturada com corante azul de tripan e contada em câmara de Neubauer, permitindo a determinação da densidade celular e viabilidade. 7) Incubação: As células são plaqueadas em frascos de cultura apropriados e incubadas a 36,5°C com 5% CO₂, garantindo sua recuperação e adaptação. 8) Registros: Todas as etapas devem ser documentadas, garantindo rastreabilidade do processo. Em resumo, o protocolo pode sofrer variações de acordo com a linhagem celular utilizada.

PROTOCOLO MODELO DE DESCONGELAMENTO CELULAR SEM CENTRIFUGAÇÃO PARA LINHAGENS CELULARES ADERENTES

Esse protocolo pode variar de acordo com procedimentos adotados em cada laboratório.

 

O conteúdo a seguir foi adaptado do procedimento descrito na dissertação de mestrado da autora:

KULIGOVSKI, Crisciele. Estabelecimento de banco de linhagens celulares aplicadas a pesquisa científica e ensaios toxicológicos in vitro. 2020. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) – Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Curitiba, 2020. Disponível em: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/24680. Acesso em 07/05/2021.

a) Retirar o(s) criotubo(s) cuidadosamente do reservatório de nitrogênio líquido; colocar a ampola em gelo seco até o descongelamento;
b) Colocar o (s) criotubo (s) em banho-maria 36,5ºC para descongelar o conteúdo do(s) criotubo(s);
c) Em cabine de segurança biológica, adicionar o conteúdo do(s) criotubo(s) em tubo cônico de centrífuga com capacidade para 15 mL contendo 9 ml de meio suplementado adequado ao crescimento celular;
d) Retirar uma alíquota da suspensão celular e realizar contagem e determinação da viabilidade celular;
e) Plaquear todo conteúdo da suspensão celular em garrafas para o cultivo celular de acordo com a área de crescimento possível;
f) Incubar a 36,5 ^oC por aproximadamente cinco horas e em seguida observar a adesão celular ao microscópio invertido;
g) Após o período 5 horas o meio de cultivo deverá ser trocado;
h) Remover o meio de cultura da garrafa de cultura celular e descartar;
i) Adicionar meio de cultura adequado à linhagem celular;
j) Incubar a 36,5ºC e atmosfera de 5% CO₂ quando indicado;

Descongelamento celular sem centrifugação para linhagens celulares aderentes. Protocolo modelo de cultivo celular. Adaptado de American Type Culture Collection (2014) e Freshney 2010. Fonte: Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A.,Souza, A.C.G., Barisón, M.J. (2025) https://BioRender.com/d64y519-Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A figura apresenta um protocolo esquemático de descongelamento celular sem centrifugação, detalhando cada etapa do processo: 1) Organização do material: Equipamentos e reagentes necessários são organizados previamente, garantindo que todos os procedimentos sejam realizados em cabine de segurança biológica. 2) Retirada do criotubo do container de nitrogênio líquido: O criotubo é retirado cuidadosamente do recipiente de nitrogênio líquido (-196°C) e colocado em recipiente com gelo seco, evitando choque térmico abrupto. 3) Descongelamento do criotubo: O criotubo é colocado imediatamente em banho-maria a 36,5°C, garantindo um descongelamento rápido e homogêneo. 4) Preparação da suspensão celular: Em cabine de segurança biológica, o conteúdo do criotubo é transferido diretamente para um tubo de centrífuga com meio de cultura suplementado, sem a necessidade de centrifugação. 5) Contagem celular e viabilidade: Uma amostra é misturada com corante azul de tripan e contada em câmara de Neubauer, permitindo a determinação da densidade celular e viabilidade. 6) Primeira incubação: As células são plaqueadas em frascos de cultura apropriados e incubadas a 36,5°C com 5% CO₂ por cerca de 5 horas, garantindo sua recuperação. 7) Troca de meio de cultura: Após o período inicial de recuperação, realiza-se a troca do meio de cultura, removendo a solução crioprotetora residual e adicionando meio fresco e suplementado. 8) Segunda incubação: As células continuam incubadas a 36,5°C com 5% CO₂, permitindo sua adaptação e crescimento adequado. 9) Registros: Todas as etapas devem ser documentadas, garantindo rastreabilidade do processo. Adicionalmente, o protocolo pode sofrer variações de acordo com a linhagem celular utilizada.

 

Para saber sobre esse tema assista a nossa videoaula e acesse o texto da transcrição:

 

 

 

 

Saiba mais em conteúdos do curso: No módulo de estrutura laboratorial e equipamentos e no módulo de congelamento celular e banco de células é possível conhecer mais caracteristicas dos equipamentos e procedimentos utilizados em criopreservação.