MÓDULO 2 – AULA 2 - Purificação Celular

E após o isolamento celular? É possível purificar ou selecionar as populações celulares de interesse?

Muitas vezes são necessários procedimentos adicionais para a seleção de populações celulares de interesse pois são obtidas populações celulares heterogêneas, ou seja, tipos celulares diferentes. Assim, para estudar uma população mais específica de células, existem técnicas de enriquecimento ou purificação celular que podem ser associadas às técnicas de isolamento que nós já vimos.

O que é purificação celular?

A purificação celular é aplicada para enriquecer, selecionar uma população celular de interesse através de procedimentos específicos utilizados para selecionar uma determinada população celular com base em uma determinada característica. Existem várias técnicas de purificação e enriquecimento celular e neste módulo abordaremos os mais utilizados.

Mas quais seriam esses procedimentos?
Meios de cultura e combinações de suplementos podem ser utilizados numa estratégia de purificação celular?

O tipo de meio de cultivo utilizado pode ajudar a selecionar determinadas populações. Existem células que precisam de combinações específicas de fatores para sobreviver e proliferar, desta forma, o meio de cultivo utilizado no estabelecimento da cultura e seus suplementos já podem de uma certa forma enriquecer uma população celular.

A adesão celular pode selecionar populações celulares diversas? É possível favorecer adesão celular com o uso de diferentes substratos celulares?

Células de diferentes tipos apresentam capacidade de adesão e migração celular diversas. Por exemplo, no método de explante para isolamento celular normalmente favorece o isolamento de células que apresentam a capacidade de migração celular a partir do tecido de origem.
Outros tipos celulares apresentam capacidade de adesão diferente de acordo com o substrato disponível. Enquanto algumas populações celulares conseguem aderir, por exemplo, ao plástico de frascos ou placas de cultivo, outros tipos celulares não têm essa habilidade.

O uso de superfícies de cultivo celular, recobertas com diferentes proteínas de matriz extracelular pode ajudar a selecionar populações que aderem mais ou menos a cada uma delas. É comum em procedimentos de isolamento celular o uso de superfícies recobertas com proteínas de matriz extracelular como colágeno. Em outros procedimentos, lavagens e trocas de meio podem ser inclusas durante os primeiros dias do estabelecimento de cultivos em frascos de cultivo. Por exemplo, se o objetivo do protocolo é isolar células aderentes, as células não aderentes podem ser descartadas nessas lavagens periódicas realizadas ao longo do processo de isolamento celular, mesmo após o plaqueamento inicial.

Que outros métodos podem ser utilizados para purificação celular?

Em outras situações a purificação celular deve ser realizada ainda na suspensão celular, sem o uso de etapas de cultivo celular baseadas em seleção por diferentes meios de cultivo, capacidade de migração ou adesão celular. Os principais métodos de purificação celular que abordaremos a seguir são a centrifugação com gradiente de densidade e a purificação celular baseada no uso de marcadores celulares, como aquela realizada por cell sorting por citometria de fluxo.

 

Técnicas de enriquecimento e purificação celular. Uma vez realizado o procedimento de isolamento celular, é possível aplicar procedimentos adicionais a fim de enriquecer ou purificar a população celular de interesse. Entre eles, é possível selecionar populações celulares a partir do uso de meios de cultivo ou substratos celulares específicos ou mesmo seguir para técnicas como separação celular por gradiente de densidade ou separação celular por cell sorting. Adaptado de Freshney, 2010. Fonte: Criado BioRender. Melo de Aguiar, A. (2025) https://BioRender.com/r33w943 adaptado do modelo “Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Isolation by Density Gradient Centrifugation” obtido de https://app.biorender.com/biorender-templates acesso em 23/01/2025. Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A imagem apresenta diferentes técnicas de enriquecimento e purificação celular utilizadas após o isolamento celular. Na primeira seção, há a representação de diferentes tipos de meios de cultivo e suplementos, como soro e fatores de crescimento, que podem ser utilizados para selecionar populações celulares específicas. A segunda seção ilustra a separação baseada na adesão celular, onde células são selecionadas conforme sua capacidade de adesão a plásticos ou substratos contendo proteínas da matriz extracelular. A terceira seção demonstra o método de separação celular por gradiente de densidade, onde células são separadas com base em sua densidade através de centrifugação, utilizando um tubo com solução de gradiente. Na última seção, está representado o método de separação celular por cell sorting, no qual células são separadas utilizando um citômetro de fluxo, permitindo a classificação com base no tamanho, complexidade celular, granulosidade ou expressão de marcadores específicos. 

Centrifugação com gradiente de densidade

Um método de isolamento e purificação é o gradiente de densidade associado com centrifugação. Coloca-se a suspensão de células na fase acima de um reagente com densidade específica, como solução de Ficoll, em tudo de centrifuga. Durante a centrifugação, as células vão se deslocar no gradiente até encontrar uma região com densidade equivalente à sua, quando param de se mover e formam as chamadas bandas ou anéis. É possível então recolher as populações celulares de cada fração que foi separada pelo gradiente de Ficoll, que são populações celulares distintas e cultivar separadamente a partir desse procedimento. O gradiente pode ser utilizado não apenas para separar as células, mas também organelas, ácidos nucleicos, entre outros componentes celulares. Um exemplo é a purificação de células mononucleares de sangue periférico com o uso de gradiantes, onde é possível separar diferentes populações em diferentes camadas ou anéis após a centrifugação. Neste procedimento, sangue diluído é colocado em contato com o Ficol e após a centrifugação, as células se separam em camadas. Por exemplo, o precitado ao fundo do tubo corresponde a eritrócitos, enquanto as células mononucleares formam um anel entre o Ficoll e o plasma.

Os protocolos de separação celular com uso de gradiente de densidade podem variar o reagente utilizado para formação do gradiente, bem como parâmetros associados à centrifugação, desta forma protocolos específicos devem ser avaliados para cada tipo celular e finalidade.

Purificação celular por gradiente de densidade. É possível utilizar soluções especiais para separação de células por diferença de densidade. No exemplo da figura temos a separação de células do sangue periférico que são adicionadas sobre solução de separação e após centrifugação é possível observar as frações de plasma, plaquetas e células mononucleares e a fração de hemácias e polimorfonucleares. Essa técnica pode ser aplicada à diversos protocolos de enriquecimento ou purificação celular. Adaptado de Freshney, 2010. Fonte: Criado em BioRender. Created in BioRender. Melo de Aguiar, A. (2025) https://BioRender.com/q04h059. adaptado do modelo “Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Isolation by Density Gradient Centrifugation” obtido de https://app.biorender.com/biorender-templates acesso em 23/01/2025 Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A figura ilustra o processo de purificação celular por gradiente de densidade. À esquerda, há uma representação de uma centrífuga utilizada para o procedimento. No centro da imagem, observa-se um tubo contendo sangue periférico diluído sobre uma solução de separação. À direita, o tubo após centrifugação a 2200 rpm por 30 minutos, exibindo a separação das frações celulares conforme a densidade. O plasma fica na camada superior, seguido por uma fina camada contendo plaquetas e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). A fração inferior contém hemácias e células polimorfonucleares, que são mais densas e sedimentam no fundo do tubo. O método é amplamente utilizado para isolar células específicas para experimentos em imunologia, pesquisa biomédica e biotecnologia. 

Cell sorting por citometria de fluxo

A citometria de fluxo é uma técnica onde é possível analisar parâmetros de partículas, no caso de células em suspensão utilizando um equipamento chamado de citômetro de fluxo. Normalmente o citômetro de fluxo é capaz de analisar parâmetros como tamanho, granulosidade ou complexidade além de identificar marcações com moléculas fluorescentes, normalmente são usados anticorpos conjugados a fluoróforos para identificação de marcadores nas populações celulares. Alguns citômetros de fluxo, equipados com sistemas de separação celular ou cell sorting podem além de analisar as populações celulares, também separá-las com base nos parâmetros avaliados.

Desta forma, é possível separar as células por tamanho, granulosidade ou complicidade e também a expressão de marcadores específicos através de anticorpos marcados com fluoróforos. Por exemplo, é possível utilizar um anticorpo conjugado ao fluoróforo que vai marcar o receptor de uma população celular de interesse. Então, no citômetro com sistema de separação celular é possível detectar quais células estão marcadas ou não e, em seguida, separar as populações celulares em positivas ou negativas para o marcador de interesse. Os citômetros de fluxo são equipados ainda com sistemas de coleta de amostras, que após selecionada a população de interesse, essa pode ser então colocada em cultivo.

Uma outra funcionalidade da metodologia de separação celular por cell sorting é o uso de procedimentos para separação de células únicas, o chamado single cell sorting onde você separa uma célula por poço. Isso possibilita a seleção de um clone da população celular original que se for proliferativo, haverá a expansão clonal, ou seja, a partir de uma única célula é possível obter uma população celular de células idênticas à primeira célula selecionada. Porém, nem todo tipo de célula permite essa metodologia, pois algumas células não resistem ao processo de expansão clonal por não resistirem a muitas duplicações celulares em cultivo.

Desta forma, é sempre importante conhecer as características da população celular de interesse a fim de definir o melhor procedimento para o seu isolamento celular, que muitas vezes requer ainda várias etapas de padronização a adaptações.

Purificação celular por cell sorting em citometria de fluxo. É possível utilizar equipamentos como o citômetro de fluxo com sistema de separação celular ou cell sorting. No exemplo da figura, A 1ª etapa consiste na citometria de fluxo analítica para definição das populações celulares de interesse. Na 2ª etapa é realizada propriamente a separação celular e na 3ª etapa é feito ao estabelecimento do cultivo celular. Adaptado de Freshney, 2010. Fonte: Criado em BioRender. Created in BioRender. Melo de Aguiar, A. (2025) https://BioRender.com/y26y234. Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A figura apresenta um esquema representativo do processo de purificação celular utilizando cell sorting por citometria de fluxo. A ilustração está dividida em três seções. Primeira etapa: Citometria analítica: No topo da imagem, um citômetro de fluxo está representado ao lado de um gráfico de dispersão, onde são identificadas duas populações celulares distintas: células positivas (+) e células negativas (-) para um determinado marcador fluorescente. Essa análise permite a definição dos parâmetros que guiarão a separação celular. Segunda etapa: Separação celular (cell sorting): No centro da imagem, um citômetro de fluxo está esquematizado separando células individuais. As células marcadas positivamente (+) são desviadas para um lado, enquanto as células negativas (-) seguem outro trajeto, sendo coletadas separadamente. Terceira etapa: Cultivo das células separadas: Na parte inferior da imagem, há a representação de uma cabine de segurança biológica, onde as células separadas são transferidas para frascos de cultivo. Cada frasco contém um meio de cultura específico, garantindo a viabilidade das células para futuros experimentos.  

Para saber sobre esse tema assista a nossa videoaula e acesse o texto da transcrição: