Módulo 7Criopreservação e Banco de Células
MÓDULO 7 – AULA 2
Criopreservação – procedimentos e equipamentos
Como é realizado o procedimento de criopreservação e quais equipamentos são utilizados?
A criopreservação envolve o uso de reagentes como crioprotetores, materiais e equipamentos próprios e nessa sessão vamos abordar mais algumas informações sobre esse procedimento.
O que são crioprotetores?
Para que as células recuperem a viabilidade celular no descongelamento celular, é fundamental o uso de substâncias que protejam as células durante o processo de criopreservação, são os chamados crioprotetores. A principal função desses agentes é proteger as membranas celulares de rompimento causado pelos cristais de gelo durante o processo de congelamento (VINCI e PAREKH, 2003) e as substâncias mais utilizadas são glicerol e o dimetilsulfóxido (DMSO). Contudo, ambos são tóxicos e após o descongelamento celular devem ser removidos (ATCC, 2014). A concentração desses crioprotetores e mesmo outros elementos presentes nesse meio de criopreservação dependem, variam de acordo com o tipo de linhagem celular.
Existe uma velocidade ideal para realizar o congelamento celular?
Independente do sistema de congelamento celular, o recomendado é que o processo de decaimento da temperatura seja lento, na faixa de -1ºC por minuto. À medida que ocorre a formação de cristais de gelo e o aumento do soluto no meio extracelular, pelo processo de osmose a água intracelular vai para o meio extracelular. Durante o processo de desidratação há redução do volume celular de forma gradual. Aliada à presença de crioprotetores que alteram a fluidez da membrana plasmática, os danos causados pelos cristais de gelo são minimizados enquanto a célula permanece congelada a baixas temperaturas (Alves & Guimarães, 2010; Freshney, 2010).
Congelamento celular lento. O processo lento de criopreservação é o que confere melhor rendimento para a recuperação de células viáveis após o descongelamento. Na visão esquemática, é possível comparar o congelamento rápido e sem crioprotetor, onde os cristais de gelo se formam e causam mais danos na membrama plasmática, reduzindo assim a viabilidade celular após descongelamento, muitas vezes inviabilizando a recuperação do cultivo. Em contrapartida, o congelamento lento com crioprotetor, há desidratação gradual com redução do volume celular e consequente menos danos à membrana plasmática que está mais resiliente à danos, com melhor recuperação de células viáveis após o descongelamento celular. Adaptado de Alves & Guimarães (2010) e Freshney (2010) Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A. (2025) https://BioRender.com/n67x408 Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A figura apresenta um gráfico esquemático de temperatura ao longo do tempo, demonstrando dois cenários de congelamento celular: 1) Congelamento rápido sem crioprotetor: A célula é exposta a temperaturas muito baixas rapidamente, formando cristais de gelo intracelulares que danificam a membrana plasmática e organelas celulares. Esse método reduz drasticamente a viabilidade celular após o descongelamento. 2) Congelamento lento com crioprotetor: O resfriamento gradual permite que a célula perca água de forma controlada, reduzindo o volume celular e prevenindo a formação de cristais de gelo prejudiciais. O crioprotetor, como o DMSO, protege a membrana celular contra danos estruturais, resultando em maior recuperação celular após descongelamento. A criopreservação lenta é o método preferencial para preservar a integridade celular e garantir a viabilidade após o armazenamento em temperaturas ultra baixas (-80°C ou nitrogênio líquido).
Congelamento celular
O primeiro passo para a criopreservação é o preparo da suspensão celular na presença de solução de congelamento com crioprotetores, que
deve apresentar uma concentração celular na faixa de 1 a 10 x106 células por ml, e normalmente se utiliza 1 ml em cada um dos criotubos.
Existem vários procedimentos para criopreservação, e variam entre os laboratórios, sejam sistemas automatizados ou sistemas manuais, independente do sistema disponível, deve-se realizar o congelamento celular de forma lenta, conforme anteriormente.
Após o descongelamento celular e remoção da solução crioprotetora é possível recuperar células viáveis e ao contrário do processo de congelamento, recomenda-se que o descongelamento celular seja realizado de forma rápida, diretamente em banho-maria a 37ºC a fim de desfazimento dos cristais de gelo.
Visão esquemática do ciclo de Criopreservação. O processo de criopreservação é apresentado em visão esquemática, onde a partir da expansão de um cultivo celular é possível preparar ampolas de suspensões celulares em solução crioprotetora, geralmente de 1 a 10 x 106 cels/mL. A criopreservação lenta na taxa de -1oC por minuto é seguida de armazenamento em N2 líquido (-196oC) por tempo indefinido. O descongelamento celular deve ocorrer de forma rápida em banho-maria a 37oC. A periodicidade de descongelamento celular depende de cada rotina de laboratório, mas deve ser realizada a fim de manter as características do cultivo celular para a realização dos experimentos. Adaptado de Alves & Guimarães (2010) e Freshney (2010) Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A. (2025) https://BioRender.com/t70j673 adaptado do modelo “Cell Culture Workflow” obtido de https://app.biorender.com/biorender-templates acesso em 25/01/2025. Sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: A figura apresenta um fluxograma ilustrando o processo de criopreservação celular em laboratório. O ciclo inicia com a expansão do cultivo celular, onde células são multiplicadas em frascos de cultura. Uma vez atingida a densidade ideal, as células são preparadas em ampolas criogênicas com solução crioprotetora para evitar danos durante o congelamento. O congelamento lento, a uma taxa de -1°C por minuto, reduz a formação de cristais de gelo prejudiciais. Após esse processo, as células são armazenadas em nitrogênio líquido (-196°C) para preservação a longo prazo. No momento do uso, as células são descongeladas rapidamente em banho-maria a 37°C e transferidas para meio de cultura fresco, retomando seu crescimento normal. Esse ciclo pode ser repetido conforme necessário para manter a integridade celular e garantir a reprodutibilidade dos experimentos.
Saiba mais em conteúdos do curso: Conforme já visto em módulos anteriores, como o módulo sobre estrutura básica de laboratório de cultivo celular, equipamentos e técnicas básicas, é possível ver os principais equipamentos utilizados, que também podem ser acessados no módulo de estrutura de laboratório s e equipamentos e os procedimentos práticos envolvidos com congelamento e descongelamento celular.
Para saber sobre esse tema, assista a nossa videoaula e acesse o texto da transcrição:
