Como manter as células vivas e funcionais em cultura?

1 - Fornecimento de condições físico-químicas adequadas na incubadora ou sala de cultura:  

- Temperatura: deve ser semelhante à temperatura corporal dos animais. Em geral, as células toleram bem temperaturas inferiores a temperatura do animal de origem, mas não superiores. P.ex., células de mamíferos são mantidas a 37°C (36-38°C), enquanto de peixes de águas frias entre 4-24°C.

- Pressão parcial de CO₂: determinada em função do sistema de tamponamento do meio de cultura e valor de pH requerido. Necessário manter uma pCO₂ acima da atmosférica para meios de cultura com tamponamento baseado em bicarbonato/ácido carbônico. P.ex., para células de mamíferos, com meio de cultura tamponado com bicarbonato de sódio e pH 7,2-7,4, a pCO₂ é normalmente mantida em 5%.
- Umidade: é mantida em incubadoras com atmosfera úmida para evitar a perda de água do meio de cultura por evaporação nos de frascos de cultura não selados. Nas culturas celulares mantidas em frascos totalmente selados pode-se empregar estufas secas (sem controle da umidade).

2 - Recipientes para cultura:

- Frascos de cultura: de vidro ou plástico apropriados com superfícies tratadas para facilitar a adesão das células, como presença de carga elétrica negativa ou moléculas de matriz extracelular (para células aderentes*) ou que permitam crescimento adequado em suspensão (para células não aderentes**).
*Células aderentes ou dependentes de ancoragem: células que requerem estar aderidas a superfícies sólidas para sobreviver e proliferar.
**Células não aderentes ou independentes de ancoragem: células capazes de sobreviver e proliferar em suspensão (não aderidas a superfícies sólidas).

3 - Nutrientes e fatores diversos fornecidos em solução com pH e osmolaridade adequados:

- Meio de cultura: mistura nutritiva rica em sais inorgânicos contendo íons como cálcio, ferro, magnésio, potássio, sódio e cloreto; aminoácidos, vitaminas, glucose e outros componentes. P.ex., DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), Leibovitz's L-15 Medium, RPMI 1640, F12. Esses meios de cultura devem possuir valor de pH e osmolaridade apropriados para a espécie cujas células são cultivadas. São normalmente tamponados pela presença de bicarbonato de sódio (NaHCO₃), HEPES (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonic acid) ou alta concentração de aminoácidos, e suplementados com soro de origem animal (p.ex., soro fetal bovino, soro de cavalo)

- Soro animal: mistura não definida rica em proteínas e peptídeos, lipídios, hormônios, inibidores de protease, e fatores necessários para adesão, sobrevivência, crescimento e proliferação de muitas células (mitógenos, fatores de crescimento e fatores de sobrevivência). Alternativamente ao uso de meio de cultura suplementado com soro animal, muitas linhagens celulares podem ser cultivadas em meios de cultura com suplementação definida (meio livre de soro).

- Antibióticos e antifúngicos: embora não requeridos para a cultura de células animais, é comum o uso de antibióticos (p.ex., gentamicina, estreptomicina/penicilina) e antifúngicos (p.ex., anfotericina B) para reduzir o risco de contaminação microbiana ou sua disseminação nas culturas celulares. Nesse sentido, é importante selecionar antibióticos e/ou antifúngicos que não sejam tóxicos para o tipo celular cultivado e que não interfiram ou apresentem o mínimo de interferência com as funções celulares de interesse.

Para saber sobre esse tema assista a nossa video-aula e acesse o texto da transcrição:

Para manter as células viáveis em cultivo celular, de uma forma simplificada é necessário fornecer o substrato celular, no caso frascos ou placas de cultivo, as células necessitam de nutrientes e outros fatores que podem ser fornecidos pelo meio de cultivo adicionado aos frascos ou placas de cultivo e ainda é necessário manter controle de temperatura, umidade e de pH, para tal as células em cultivo normalmente são mantidas em estufas de CO₂.

Saiba mais em conteúdos do curso: No módulo meios de cultivo e substratos celulares e no módulo de estrutura básica de laboratório e equipamentos, esses temas serão abordados com mais detalhes.

Como manter as células vivas em cultura. Células animais são cultivadas em incubadoras com injeção de CO₂ ou estufas convencionais (sem injeção de CO₂), conforme o sistema de tamponamento do meio de cultura e tipos de frascos de cultura empregados. Em geral, empregam-se meios de cultura suplementados com soro fetal bovino, ou meios de composição totalmente definida. Conforme a escala e propósito da cultura, as células podem ser mantidas em garrafas de cultura, placas e microplacas, frascos agitadores ou biorreatores. Fonte: Baseado em Freshney, 2010. Criado em BioRender. Melo de Aguiar, A. (2024) https://BioRender.com/m029130 sob licença CC-BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Descrição estendida da legenda: Infográfico ilustrando a manutenção de células em cultura. A imagem está dividida em três seções: uma incubadora com injeção de CO₂, utilizada para manter as células a 37°C e 5% de CO₂; um frasco com meio de cultivo suplementado, contendo meio base e soro fetal bovino; e garrafas de cultivo celular empilhadas, contendo células e meio de cultura. 

Quais outras características as células em cultura apresentam?

- Número de cromossomos: em geral, linhagens celulares finitas e culturas primárias são compostas por células que apresentam número de cromossomos normal, ou seja, igual ao das células do organismo de origem. Já linhagens celulares contínuas costumam apresentar número de cromossomos anormal (aneuploidia), com cromossomos ou porções de cromossomos a mais, além de variação no número de cromossomos entre células de uma cultura (heteroploidia).
- Senescência celular: esse processo está associado a um envelhecimento e redução da capacidade proliferativa das células, levando a um declínio da cultura. Ocorre em linhagens celulares finitas, mas não em linhagens celulares contínuas.
- Mudanças metabólicas: as células em cultura apresentam mudanças no metabolismo energético (p.ex., aumento da dependência da glicólise para a síntese de ATP), capacidade de biotransformação de drogas (p.ex., há redução da expressão de enzimas de fase I e II em hepatócitos cultivados) etc. Essas alterações podem ocorrer devido a diferenças nas condições de cultura com relação ao ambiente in vivo, como menor disponibilidade de O₂ para as células, ausência de componentes sistêmicos como hormônios ou interações heterotípicas (entre células de diferentes tipos), bem como pela ausência de uma arquitetura tridimensional adequada etc. Em geral, culturas primárias e linhagens celulares finitas apresentam características metabólicas mais próximas às das células do tecido de origem que as linhagens celulares contínuas, em parte porque que as condições de cultura não recriam com precisão as condições in vivo, gerando uma pressão seletiva para subpopulações celulares.